汇集行业专家之智，探寻白酒之秘

　　目前白酒行业内普遍存在大曲品质不稳定的问题，已有研究表明制曲原料对大曲的品质有重要影响，小麦源微生物对高温大曲菌群有重要贡献，因此从原料微生物的角度着手，揭示原料微生物在发酵过程中的迁移规律和作用机制，有利于对大曲微生物菌群的形成进行干预、从而提高大曲品质。

　　5月12日，由中国酒业协会主办，中国贵州茅台酒厂（集团）有限责任公司承办的中国酒业协会白酒技术创新战略发展工作委员会2023年度工作会议在贵州茅台召开，会议中的《小麦源微生物在高温大曲制曲过程中的迁移规律和作用机制》项目演讲正是围绕该内容展开，整理部分发言，内容如下：

　　01：关于研究背景

　　“曲为酒之骨”，大曲作为白酒糖化发酵剂历史悠久，至今仍具有无法替代的作用。其制作过程通常采用开放式的自然接种形式，原料和环境微生物的参与形成了复杂独特的微生物群落，对于白酒独特风味和品质的形成具有重要意义。通过网罗原料和环境微生物的多菌种混合发酵是高温大曲制作过程的典型特征，以小麦为原料的固态基质既是微生物的营养源也是重要的生长微环境。

　　目前，主要依靠经验控制的制曲工艺是制约大曲品质稳定性和生产标准化的主要问题。

　　近年来，研究人员采用多种方法，如利用传统培养法对可培养微生物进行分离纯化，利用分子生物学方法对不可培养微生物进行鉴定等对不同类型大曲的微生物多样性进行研究，得到了一些大曲微生物多样性以及微生物群落结构演替规律的结论，但原料源功能微生物在制曲过程中的迁移演变规律及其对大曲功能及品质特征的影响尚不清楚。

　　基于此，本项目拟采用高通量测序技术和传统培养法追踪高温大曲制曲过程中微生物群落演替并挖掘发酵过程中的原料源功能微生物，进一步借助宏代谢组学技术分析制曲过程中的特征风味物质和非挥发性代谢物的变化，阐明原料源功能微生物在制曲过程中的迁移规律及其对大曲风味代谢功能的调控作用，基于菌系、物系和酶系多层面揭示原料源功能微生物在强化大曲中的应用潜力，为建立原料选用标准和提高大曲品质奠定理论基础，也为实现传统固态发酵工业化和标准化提供技术支持。

　　02：主要研究内容

　　制曲过程中微生物群落组成分析：

　　采集小麦和制曲过程中不同阶段的大曲样本，并对其微生物进行传统培养法和高通量测序结合分析。通过扩增子测序技术测定原料和大曲菌群结构，并进行对比和溯源分析，综合分析制曲过程中菌群和代谢功能的动态变化，明确制曲过程中微生物迁移规律。

　　制曲过程中的风味物质和代谢物变化分析：

　　制曲过程中的大曲样本同时进行风味物质和非挥发性代谢物的分析，结合微生物分析结果进行关联网络分析，挖掘重要微生物的代谢特征，表征微生物与风味物质之间的关系，讨论微生物在制曲过程中的代谢功能，从更客观的角度阐明小麦源微生物对大曲菌群和风味物质的贡献。

　　小麦源功能微生物的筛选及其在强化大曲中的作用：

　　结合已有对高温大曲中纯培养小麦源微生物功能的研究结果以及群落的结构分析结果，寻找对高温大曲群落贡献较大的微生物。测定菌株环境耐受性和产酶活性，筛选得到小麦源功能微生物。通过模拟大曲固态发酵体系，探索外源添加小麦源功能微生物对大曲微生物群落组成、代谢物谱和酿酒功能特性的影响，进而阐明小麦源微生物对于高温大曲的重要意义。

　　03：部分研究成果

　　小麦和大曲中的可培养微生物计数：

　　采集制曲原料小麦和制曲培菌第0、4、7、12、15、27、40天的过程曲样品进行可培养微生物计数，结果如图所示。小麦携带着一定数量的细菌和真菌，参与到大曲微生物群落的初始组装，之后可培养微生物的数量呈现一定的波动变化，需氧菌落总数、耐热菌数、乳酸菌和真菌的数量均在培菌前4天有明显的上升趋势并在第4天达到峰值。

　　刚入仓时曲块核心温度上升缓慢，湿度大，适宜微生物的生长，此阶段以培养霉菌和富集酶系为主。

　　培菌第7天，进行第一次人工翻曲以调节不同位置曲块的温度和湿度相对均匀，此时可培养微生物数量有明显的下降趋势，之后温度又逐渐攀升，有利于耐热菌尤其是芽孢杆菌的生长繁殖，而霉菌的生长此后逐渐受到抑制，乳酸菌的耐热性也较差因此数量也有所减少。

　　第40天培菌结束时，需氧菌落总数、耐热菌数、乳酸菌和真菌数量分别达到了7.56、6.62、4.50和4.60 log cfu/g。

　　微生物和代谢物的相关性分析：

　　进一步将细菌微生物组和代谢组进行相关性分析，可以更直观地预测并理解微生物与代谢物的相关性，如图所示。

　　葡萄球菌属（staphylococcus）和泛菌属（pantoea）与果糖产量呈正相关，与焦谷氨酸产量呈负相关，葡萄球菌属还与一些non-vocs如苏糖酸盐和柠康酸盐呈负相关作用，而泛菌属与一些vocs呈负相关，如1-辛烯-3-酮、2-甲基丁醛和苯乙醛。

　　嗜热放线菌属（thermoactinomyces）与果糖含量有负相关作用，对甘露醇、赤藓糖醇、琥珀酸、焦谷氨酸和柠康酸有正向促进作用，嗜热放线菌属可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖淀粉酶等水解蛋白质和淀粉，代谢产生vocs。

　　糖多孢菌属（saccharopolyspora）与一些vocs包括1-辛烯-3-酮、2-甲基丁醛二聚体、3-甲基丁醛二聚体和苯乙醛单体之间存在正相关关系。整体来看，嗜热放线菌属和葡萄球菌属与大部分non-vocs的相关性趋势相反，而泛菌属（pantoea）和糖多孢菌属（saccharopolyspora）与vocs的相关性相反。

　　a：细菌和非挥发性有机物；b：细菌和挥发性有机化合物；c：真菌和非挥发性有机物；d：真菌和挥发性有机化合物。上述微生物为细菌/真菌相对丰度排名前10的菌属，代谢产物为通过pls-da模型筛选的组间有显著差异的挥发性物质和非挥发性物质(*表示p < 0.05；**表示p < 0.01)

　　对于真菌和代谢物相关性作用，热图结果显示嗜热子囊菌属（thermoascus）与众多代谢物呈正相关作用，其中包括3种醇(甘露醇、赤藓糖醇和阿拉伯糖醇)、3种醛(2-甲基丁醛二聚体、3-甲基丁醛二聚体和苯乙醛单体)、3种酸(甲酸盐、葡萄糖酸盐和琥珀酸盐)和2种氨基酸衍生物(焦谷氨酸盐和谷氨酰胺)。

　　chromocleista与乳酸和亮氨酸呈强正相关作用(相关性系数绝对值大于0.8)，alternaria和mycosphaerella与一些氨基酸(脯氨酸和精氨酸)及其衍生物(焦谷氨酸和4-羧基谷氨酸)呈显著负相关，而与果糖含量呈正相关，图上可以看出alternaria和mycosphaerella与大多数差异性的vocs展示出了相似的相关性作用，尤其是1-辛烯-3-酮单体、2-甲基-丁醛和3-甲基丁醛二聚体、甲基丙醛、苯乙醛单体和丙醛。

　　millerozyma被预测与葡萄糖、乳酸、乙酸、亮氨酸和缬氨酸呈正相关，rhizomucor和lichtheimia的丰度与乙酸盐呈正相关，alternaria、mycosphaerella和aspergillus这三个真菌属与代谢产物的相关性趋势相似，而thermoascus与它们的相关性趋势几乎相反。

　　细菌和真菌丰度优势菌属和代谢物的相关性分析表明高温放线菌属和葡萄球菌属与大多数非挥发性代谢物的相关性趋势相反，而泛菌属和糖多孢菌属与挥发性代谢物的相关性作用相反。链格孢菌属、小球壳菌属和曲霉菌属与代谢产物的相关性趋势相似，而嗜热子囊菌属与它们的相关性趋势几乎相反，以上关联网络分析全面展示了大曲培菌过程中多组学之间的关联性，为后续菌群的功能验证提供了思路和方向。【来源：微酒】